trim_c (trim_c) wrote,
trim_c
trim_c

Categories:

Корона в стоге сена


Эпидемия корона-вируса вызвала множество вопросов у людей, и целый ряд их связан с работой тест-систем: почему результатов приходится ждать по несколько дней? И почему мы все еще не нашли и не изолировали всех зараженных коронавирусом?

На самом деле к тому есть объективные причины - и вообще устройство тест-систем и их развитие сами по себе весьма интересны. Потому я и обратился к материалу Полины Лосевой на сайте N+1.


Размножить, чтобы увидеть

Главная трудность при обнаружении возбудителей инфекций состоит в том, что они очень маленькие. Ни вирус, ни бактерию не разглядишь в микроскоп просто так.

Точнее, разглядеть можно, но для этого необходимо поймать их в поле зрения при огромном увеличении и желательно еще предварительно покрасить. Но поскольку на то, чтобы просмотреть «вручную» весь образец крови или слюны целиком, требуется невероятно много времени, остается один выход — размножить врага.

Для этого совершенно необязательно заражать вирусом клетки человека, мы можем размножить его искусственно, а если точнее — не целый вирус, а его геном. Для этого используют метод ПЦР, полимеразной цепной реакции. Фактически это то же самое, что делает клетка, когда копирует свою ДНК при делении. Только в ходе ПЦР мы копируем искомую ДНК не один раз, а тысячи — пока ее не станет достаточно много, чтобы наш прибор смог ее «разглядеть».

В случае с коронавирусом метод выглядит так. Сам вирус — это нить РНК (и белковая оболочка, которую зараженная клетка строит, считывая информацию с РНК). Чтобы начать его размножать, необходимо перевести его в ДНК. Для этого молекулярные биологи (как и вирусы в клетке) используют обратную транскрипцию: фермент ревертаза строит ДНК на матрице РНК, фактически переписывая информацию на другой язык.

Затем начинается собственно ПЦР. В раствор с вирусной ДНК добавляют праймеры — затравки для достраивания, полимеразу — отвечающий за него фермент, а также нуклеотиды — строительные материалы для ДНК. Каждый цикл цепной реакции состоит из трех этапов:

1. Раствор нагревают, ДНК распадается на отдельные цепи.
2. Раствор охлаждают, затравки-праймеры садятся на определенные участки ДНК.
3. Раствор подогревают, полимераза начинает работать — распознает праймеры и, начиная с них, достраивает вторую цепь ДНК.

/автор полагает нас специалистами, я во всяком случае понимал не без труда. Мне кажется следует читать так: ревертаза строит полную ДНК, т.е. двойную спираль, при нагревании двойные спирали распадаются на одиночные цепи, полимераза достраивает к фрагменту одиночной цепи, выделенному праймером, его комплементарную цепь, и таким образом удваивается количество нужных фрагментов ДНК/

Таким образом, в каждом цикле мы «размножаем» вирусный геном, и количество молекул ДНК в растворе растет по экспоненте.

Раньше количество ДНК определяли по окончании реакции — пробу обрабатывали красителем для ДНК и разгоняли в геле, чтобы выделить искомые маленькие фрагменты. Тогда чувствительность метода зависела фактически от человеческого глаза — полоска ДНК на геле должна была быть достаточно толстой, чтобы ее можно было различить.

Сейчас метод устроен проще: в смесь для ПЦР сразу добавляют флуоресцентный краситель для ДНК. Поэтому длинные нити начинают светиться, а прибор с каждым циклом замеряет интенсивность свечения. Именно из-за этого сегодня метод называют «ПЦР в реальном времени» (real-time PCR). Теперь мы не зависим от собственного глаза и ограничены лишь чувствительностью прибора к свечению.



Стадии ПЦР: 1 — денатурация, разъединение цепочек ДНК (при температуре 94–96 градусов Цельсия); 2 — отжиг, праймеры садятся на определенные последовательности ДНК (около 68 градусов Цельсия); 3 — элонгация, полимераза достраивает вторую цепь ДНК, начиная с праймера (около 72 градусов Цельсия).


Пределы контроля

ПЦР в реальном времени — надежный метод, подходящий для обнаружения любых вирусов. Его эффективность не вызывает сомнений, однако необходимо понимать, что и у него есть свои ограничения. И главное — это время.

Две основные химические реакции — обратная транскрипция и ПЦР — занимают около часа каждая. Значит, на то, чтобы определить, есть в пробе коронавирус или нет, необходимо никак не меньше двух часов. Это не считая затрат на сбор пробы (чаще всего это соскоб с дыхательных путей) и подготовку реакций.

Правда, существуют тесты на вирусы, работающие быстрее и проще. Например, тест-полоски на ВИЧ, позволяющие провериться на инфекцию в домашних условиях за 20 минут.

Но секрет их в том, что они измеряют другой параметр — не количество вирусных частиц, а концентрацию антител, которые организм человека произвел в ответ на этот вирус. Антитела дополнительно размножать не нужно, поэтому и метод измерения устроен гораздо проще.

В приборе есть контейнер, где проба крови или жидкости с десен «встречается» с мечеными белками ВИЧ. Затем эта смесь поднимается с током воды вверх по тонкой мембране, и антитела, которые связались с ВИЧ, «бегут» медленнее «свободных» антител. Поэтому их можно различить в виде отдельной полоски.



В контейнере проба со щеки смешивается с образцом белков ВИЧ и «ползет» вверх по тест-полоске. До верхней полоски «добегают» свободные антитела, на нижней полоске «останавливаются» антитела, которые связались с ВИЧ.


Для коронавируса 2019-nCoV такого рода тесты тоже скоро появятся — в Сингапуре их уже начали применять. Но заменой ПЦР-диагностике они стать не могут.

Дело в том, что на производство собственных антител организму требуется время. Достоверно выявить инфекцию таким методом можно только спустя три недели после заражения (да и тесты на ВИЧ рекомендуют повторить через несколько месяцев после возможного заражения, чтобы убедиться наверняка).

В этом тоже есть своя польза: с помощью антител можно будет определить тех, кто переболел вирусом бессимптомно или с легким недомоганием, не вызвавшим беспокойства. Именно так можно будет постфактум подсчитать, насколько на самом деле заразен новый коронавирус. Но ускорить процесс поиска тех, кто болен прямо сейчас, антитела никак не помогут.

Кроме того, не стоит забывать, что 20 минут или 2 часа — это время, необходимое прибору, чтобы выдать ответ. К ним надо прибавить время на транспортировку до ближайшего центра, где производят анализ.

Дальше учитываем рабочие графики персонала клиники, берущего пробу, и сотрудников лаборатории, осуществляющих анализ, — и в результате получаем те несколько дней, которые должны пройти, прежде чем человек узнает, заразился он коронавирусом или нет.

Хранители метода

Неизбежно возникает вопрос: неужели это настолько сложный анализ, что для него необходимы специальные лаборатории? Почему бы, например, не поставить приборы прямо в аэропорту, чтобы проверять людей на въезде в страну?

Ответ заключается в том, что, как бы просто ни выглядел метод ПЦР в реальном времени, для него нужны как минимум бокс для смешивания реактивов и амплификатор (прибор, способный циклически нагревать и охлаждать раствор, а также замерять интенсивность свечения), а они стоят недешево и требуют стерильности.

Но важнее то, что в каждой такой лаборатории должны быть праймеры — затравки для посадки ДНК-полимеразы. На самом деле тест-система — это просто пара праймеров, подобранных таким образом, чтобы связываться только с определенным участком коронавирусной ДНК и не реагировать ни на один другой вирус и тем более на ДНК человека.

Сейчас в России действуют две таких тест-системы: одна позволяет распознать только коронавирус, другая реагирует на последовательность, общую для коронавируса и вируса атипичной пневмонии SARS.

Разработкой этих праймеров в мире параллельно занимаются десятки лабораторий. Само по себе это не очень сложное занятие: в отличие от создания теста на антитела, для разработки праймеров достаточно только расшифрованного генома.

Информация о геноме появилась в сети уже 10 января, после чего любой специалист мог заняться поиском последовательности ДНК, уникальной именно для этого вируса. Дальше к ней надо подобрать подходящий праймер-затравку и проверить, что он стабилен и садится на ДНК при температурах, возникающих в ходе ПЦР.

«Такой тест за короткое время может сделать любой грамотный молекулярный биолог», — утверждает профессор вирусологии, заведующий лабораторией Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии Алексей Забережный.

«Но нужно доверить кому-то одному», — говорит он. В России этим избранником стал Государственный научный центр «Вектор» в Новосибирске. Саму тест-систему сотрудники «Вектора» создали буквально за одну-две неделие. Но снабдить ею все диагностические центры страны — куда более сложная задача.

«Понятно, что ни за неделю, ни за месяц они физически не смогут произвести эти тесты и распространить их по всей России, — объясняет Забережный. — Передать его за две тысячи километров за один день можно только по интернету».

Поэтому, по словам ученого, диагностическая лаборатория получает лишь последовательности праймеров и температуру реакции, а уже дальше может синтезировать их самостоятельно и запустить тестирование. Правда, отмечает Забережный, такая диагностика будет не вполне легитимна.

«Для валидации диагностики необходим физический положительный контроль (то есть образец вируса. — Прим. N + 1), а его ни у кого не было. Если Роспотребнадзор привез положительные образцы в Новосибирск, то тогда я снимаю шляпу, тогда молодцы», — говорит ученый.

В то же время в других странах мира принято пересылать диагностическую тест-систему целиком, не оставляя ее сборку на откуп лабораторий. В комплект, как правило, входит и положительный контроль.

Издание «Медуза», получившее доступ к протоколу использования тест-системы, разработанному «Вектором», тоже упоминает использование положительного контроля — а значит, едва ли процесс ограничивается пересылкой последовательности праймеров по интернету.

Таким образом, ко времени, которое необходимо на проведение анализа, нужно добавить еще время на пересылку и получение тест-системы.

Однако главное препятствие в погоне за коронавирусом 2019-nCoV состоит даже не в том, что ловить его долго, и не в том, что это удовольствие не из дешевых, а в том, что не на каждом этапе болезни его можно достоверно поймать, даже если хотя бы по одному разу проверить всех жителей Земли (что совершенно нереально).

У метода ПЦР есть свои ограничения по чувствительности: он не способен выявить вирус, если в пробе меньше десятков или сотен копий его РНК. При таких концентрациях слишком мала вероятность, что праймеры и полимераза случайно «столкнутся» с нужной молекулой в растворе. Но как только концентрация вирусных геномов становится больше, появляются и первые симптомы болезни, которые и так заставляют нас быть настороже.

Таким образом, поймать вирус в первые моменты после заражения, чтобы изолировать всех его носителей, технически невозможно. И в нашей кажущейся беспомощности перед лицом эпидемии виноваты не только нехватка денег, медленное реагирование и несовершенство системы здравоохранения, но и — не в последнюю очередь — броуновское движение, мешающее праймерам выхватить редкий вирусный геном из разбавленной пробы бессимптомного носителя.


Мне кажется что материал интересен не столько модной темой коронавируса, сколько рассказом какими сложными и тонкими методами идентификации работает современная микробиология и какие сложности возникают при внедрении уже вполне понятного метода, доведенного до технологии, в реальную медицинскую практику, особено когда ситуация эпидемии и участвуют в процессе буквально миллионы людей.
Tags: n+1, вирус, тест
Subscribe
  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic

    Your reply will be screened

    Your IP address will be recorded 

  • 4 comments